杂交构树低温应答磷酸化蛋白质组学研究

邳植彭献军沈世华

杂交构树属于桑科构属,多年生小乔木,具有速生、丰产、优质等特点,在饲料、造纸、生态绿化、食用等方面有巨大的应用前景。杂交构树的大量种植,可以实现经济、生态、社会三大效益的统一。由于杂交构树仅能在极端气温-20℃以内安全越冬,研究杂交构树低温应答模式,对进一步提高杂交构树经济价值具有重要意义。本研究采用NanoLC-ESI-LTQ-Orbitrap质谱对低温应答过程中磷酸化蛋白质组变化进行分析,结合超薄切片电镜观察、生理生化检测、生物信息学分析等手段,探索杂交构树在磷酸化水平低温应答的分子机制:1.杂交构树幼苗4°C处理6小时后,叶绿体开始积累大量淀粉粒;2天后,叶绿体基粒数量明显减少,叶绿体和细胞核双层膜结构也出现损伤。2.随着低温处理持续各种指标均出现显著变化,暗示着低温对叶片损伤逐渐加剧。处理6天后,Fv/Fm值达到最低并且相对电导率上升速率剧增,说明此时光合系统和膜系统受到严重损伤,耐冷能力优于玉米、水稻等冷敏感作物,接近于杨树。3.通过比较处理6小时和48小时杂交构树磷酸化蛋白质组,总共发现933个磷酸化位点发生显著变化,属于719个磷酸化蛋白。低温转录组比较发现,719个差异磷酸化蛋白中有551个磷酸化蛋白的m RNA在响应低温过程中没有发生显著变化。这说明,磷酸化修饰在杂交构树低温应答过程中不可替代。4.共富集到9个基序。推测MAPKs、CDKs、CDPKs、CKIIs可能是引起磷酸化水平变化的主要激酶。5.对差异磷酸化蛋白质进行GO注释结果显示差异磷酸化蛋白主要参与蛋白修饰、信号转导、翻译过程。另外,物质运输和细胞组分组织分别还在低温处理6小时和48小时后被显著富集。在蛋白修饰方面,超过70%的差异磷酸化蛋白具有蛋白激酶或磷酸酶活性,暗示磷酸化级联反应在低温应答过程中具有重要作用。6.基于STRING数据库预测构建低温响应蛋白激酶和磷酸酶互作网络。结果显示蛋白互作网络涉及MAPK级联反应,以及光、ABA、cyclin、乙烯、BR和Ca2+调控的信号通路。网络互作分析发现,一个同时具有蛋白激酶和磷酸酶结构域的蛋白(编号P1959)位于网络中心。P1959可能与52个参与低温应答的蛋白互作,这些蛋白广泛参与MAPK级联反应和ABA、乙烯、BR、Ca2+调控的信号通路。基于以上分析,推测BpSTN8、BpPHOT1、BpSIZ1、BpICE1和BpPLC2的磷酸化修饰位点在调控光合系统稳定、CBF/DREB途径和磷酸肌醇代谢中起到重要作用。